自20世紀40年代起，人們都采用兔眼Draize試驗評判化妝品原料及其成品的眼刺激。但動物試驗在化妝品企業中開展難度、成本等相對較高，因此動物替代方法成為了企業內部的首選。

測試類型可分為四類，包括細胞（如3T3成纖維細胞，人原代角質形成細胞等）、離體器官（如牛角膜、豬角膜、兔眼球、雞眼球等）、類器官（如雞胚等）、人工組織方法（如重建角膜Epiocular、3D表皮模型等）。其中絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）取樣方便、容易，中胚層富含的血管網絡很好地模擬了眼結膜結構，因此，是眼刺激性試驗替代方法中廣泛使用的模型之一。

目前使用CAM用于眼刺激測試的方法有三種：雞胚絨毛尿囊膜試驗（Hen’s egg test on the chorioallantoic membrane,HET-CAM）,雞胚絨毛尿囊膜血管試驗（Chorioallantoic membrane vascular assay, CAMVA）,雞胚尿囊膜臺盼藍染色試驗(the chorioallantoic membrane-trypan blue staining assay, TBS-CAM)。本文將針對以上三種動物替代試驗展開介紹。

1. 雞胚絨毛尿囊膜試驗（HET-CAM）

HET-CAM最早于1985年由Luepke建立，隨后國內外對于HET-CAM的研究及應用比較廣泛，2009年中國質量監督檢驗檢疫總局對于HET-CAM發布了檢驗檢疫行業標準SN／T2329-2009，規范了HET-CAM的操作及評判標準。由于化學物對CAM的刺激反應多種多樣，因此HET-CAM以出血、血管溶解、凝血作為觀察終點，即在雞胚發育第9天時神經組織和痛感還沒形成的階段，檢測受試物導致CAM產生三種反應的嚴重程度。針對不同狀態及劑型的化妝品或原料有不同的評價方法，對于透明液體受試物應采用反應時間法，記錄反應過程中出現三種反應的時間點，從而計算樣品的刺激性。對于膏體或混濁液體則采用終點評價法，在反應終點時對反應現象進行評價。反應時間法更強調的是血管效應出現的時間快慢，與樣品最終造成的血管效應嚴重程度無關。終點評價法則更強調的是最終產生的的嚴重程度，過程中對血管效應產生的快慢無關。雖然在標準中記載的兩種方法是針對不同劑型的方法處理，但建議篩選和比對配方、原料時，最好是采用同一種處理方法進行測試，對比性和參考性更強。

研究發現，HET-CAM可較好地檢測表面活性劑以及以表面活性劑為基礎的產品的刺激性，對于一些能對CAM進行著色的物質，HET-CAM不適用，且實驗存在一定的主觀性，實驗員在操作時，應對血管現象了解、熟悉，避免出現誤判。

2. 雞胚尿囊膜臺盼藍染色試驗(TBS-CAM)

在HET-CAM的基礎上通過添加臺盼藍染色進行改進，可克服HET-CAM實驗主觀性強和損傷難量化的缺點。

臺盼藍是一種廣泛用于區分存活細胞與死亡細胞的染料，常用于檢測細胞膜的完整性和細胞的存活率。喪失活性或細胞膜不完整的細胞可被臺盼藍染成藍色而正常的活細胞細胞膜結構完整，能夠排斥臺盼藍，細胞不會被染成藍色。TBS-CAM正是利用臺盼藍的這個特點，通過受試物與CAM接觸后，損傷的CAM會吸收加入的臺盼藍，一定時間后剪下CAM，沖洗、干燥并稱重，萃取后測量其萃取液吸光度值，通過計算單位膜重量吸收的臺盼藍的量（ISTB）作為檢測終點，以此用來評判受試物的刺激性。TBS-CAM不受劑型的束縛，即染色原料或化妝品不影響檢測結果的觀察，解決了HET-CAM不能用于染色物質的測試的難題，亦能對損傷程度進行量化，減少人為地對刺激性進行評分，客觀地對刺激進行評價。

3. 雞胚絨毛尿囊膜血管試驗（CAMVA）

CAMVA采用的是孵化至第10天的雞胚，將化妝品原液或特定濃度下的化妝品原料滴加于聚四氟乙烯樹脂環內，培養30min后觀察環內血管效應-鬼影血管、充血以及不同程度出血并予以評分，最終計算其算術平均值即得到NC值。NC值則可以評判物質在某個特定濃度下的刺激性。CAMVA適用于評價化妝品或一定濃度下的原料的刺激性，與使用濃度相關，可測得不同濃度下物質的刺激性。與HET-CAM的終點評價法的共同點則是在于，CAMVA更強調的是通過樣品致CAM最終的損傷嚴重程度進行評價。

綜上所述，三種試驗各有其優缺點（見表1），各在不同維度對刺激性進行評價，在化妝品配方及原料篩選時，可選用一種或者組合的形式對其進行評價，如HET-CAM與TBS-CAM試驗的結合，可從血管效應產生的快慢以及對實驗損傷程度的量化兩個維度對受試物進行評價，也結合了主觀與客觀的評價，減少誤差。

表1

這類試驗材料方便易得，操作相對簡單易行，設備及耗材成本相對較低，結果易于觀察，在日化企業中搭建可行性較強。早期被美國機構替代方法管理小組，歐洲委員會，英國內務府，歐洲化妝品、盥洗用品和香水協會及日本、德國等廣泛研究與評價。

在中國，這方面的研究也有一定的進展，報道顯示此方法是比較有前途的替代方法。隨著化妝品行業及消費者的安全性意識的提高，以及替代試驗的研究及技術的越來越成熟，包括基于CAM開展的試驗方法應用越來越廣泛。

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